SPF級6-8周齡NU/NU nude mouse，雌性購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。該品系小鼠來源于NIH，專業(yè)名稱Crl: NU-Foxn1^nu，為無毛、白化背景，因攜帶Foxn1^nu突變，胸腺發(fā)育不良，不能產(chǎn)生T細(xì)胞。

1. 小鼠尾部MmuPV1感染

三溴乙醇小鼠麻醉，按每公斤體重腹腔注射240mg。待小鼠麻醉后，利用刀片在小鼠尾部反復(fù)輕輕刮擦20次左右，取10μl病毒液（6×10⁸ VGE）滴加到刮擦過的尾部。每周觀察2次，待尾部病變直徑接近1cm時，安樂小鼠并收集腫瘤。部分腫瘤組織置于福爾馬林固定液用于組織學(xué)研究；部分腫瘤組織置于液氮中速凍，并保存于-80℃進(jìn)行后續(xù)感染和分子研究。

2. 小鼠尾部MmuPV1 DNA提取

使用分離柱法分離組織DNA。取MmuPV1感染尾部的增生部位，利用DNeasy Blood & Tissue Kit （Qiagen）。提取方法如下：將25mg切成盡量小塊置于1.5ml EP管中，加入180μl Buffer ATL及20μl Proteinase K，震蕩混勻，56℃孵育1-3h至增生組織完全裂解，孵育期間間斷震蕩；震蕩15s，加入200μl Buffer AL，震蕩充分混合，加入200μl無水乙醇，再次充分震蕩混勻；混合物轉(zhuǎn)移至DNeasy Mini spin column，6,000×g（8,000 rpm）離心1min，棄廢液；柱子中加入500μl Buffer AW1，6000×g（8000 rpm）離心1min，棄廢液；柱子中加入500μl Buffer AW2，20,000×g（14,000 rpm）離心3min，棄廢液；將珠子置于新的1.5ml或2ml離心管，在柱子的膜上加200μl Buffer AE，室溫靜置1min，≥6000×g（8000 rpm）離心1min。

3. 小鼠尾部MmuPV1的PCR檢測

將小鼠尾部增生組織置于PBS中，利用勻漿器高速勻漿3min。勻漿液10，000 rpm離心3min，將上清液轉(zhuǎn)移到新1.5ml EP管中。配置反應(yīng)體系，上下游引物分別為對MmuPV1 E2基因，MmuPV1_E2_1（5`- GCC CGA AGA CAA CAC CGC CAC G-3`）和MmuPV1_E2_2（5'-CCT CCG CCT CGT CCC CAA AAA ATG G-3'）。反應(yīng)條件：95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 60s，68℃ 45s，40個循環(huán)；68℃ 10min。

4. 小鼠尾部MmuPV1感染組織病理學(xué)檢測

安樂小鼠，解剖采集尾部增生部位皮膚，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE染色）。方法簡述：組織塊經(jīng)10%的多聚甲醛固定、脫水透明后，置于熔化的石蠟中進(jìn)行包埋，進(jìn)而制作石蠟切片；切片脫蠟后進(jìn)行HE染色；進(jìn)一步的脫水透明，封片，顯微鏡下觀察。

5. RNAscope原位雜交

安樂小鼠，解剖采集尾部增生部位皮膚置于10%多聚甲醛固定、脫水透明后，置于熔化的石蠟中進(jìn)行包埋，進(jìn)而制作石蠟切片，切片進(jìn)行后續(xù)RNAscope原位雜交，具體實驗步驟如下：

（1）載玻片脫蠟：60℃烤片1h，二甲苯脫蠟2次，每次5min，100%酒精2次，每次1min，切片朝上放到吸水紙上，室溫靜置干燥5min；

（2）雙氧水靶標(biāo)修復(fù)：切片滴加約5-8滴RNAscope^®雙氧水，室溫孵育10min，蒸餾水清洗切片3-5次后，將載玻片浸沒到煮沸的1×RNAscope^®靶標(biāo)修復(fù)液中放置15min，蒸餾水清洗3-5次，100%乙醇中清洗1次，室溫靜置干燥；

（3）畫疏水圈：使用Immedge^TM疏水筆在樣本周圍化疏水圈2-4次；

（4）將載玻片置于HybEZ^TM載玻片架中，滴加5滴RNAscope^®蛋白酶plus，放入HybEZ^TM濕盒，放回40℃雜交爐 30min。蒸餾水洗3次；

（5）探針雜交：載玻片滴加4滴E1^E4探針，再放入濕盒，雜交爐40℃孵育2h，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（6）雜交Amp1：載玻片上滴加4滴Amp1，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育30min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（7）雜交Amp2：載玻片上滴加4滴Amp2，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育15min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（8）雜交Amp3：載玻片上滴加4滴Amp3，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育30min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（9）雜交Amp4：載玻片上滴加4滴Amp4，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育15min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（10）雜交Amp5：載玻片上滴加4滴Amp5，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育30min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（11）雜交Amp6：載玻片上滴加4滴Amp6，放回濕盒，雜交爐雜交爐40℃孵育15min，將載玻片浸沒于1×清洗緩沖液中，室溫，每次2min；

（12）信號檢測：棄掉液體后，載玻片上滴加120μl DAB工作液，室溫靜置10min，去除DAB工作液，蒸餾水洗3-5次；

（13）載玻片復(fù)染：載玻片放入蘇木精染色液中，室溫靜置2min，蒸餾水洗3-5次，利用0.02%氨水洗一次，蒸餾水再洗3-5次；

（14）載玻片脫水：載玻片放入70%乙醇，室溫靜置2min，100%酒精，室溫靜置2min，100%酒精，室溫靜置2min，二甲苯溶液，室溫靜置5min；

（15）封片：載玻片風(fēng)干后，滴加1滴Cytoseal封片劑，蓋上蓋玻片，風(fēng)干載玻片5min。

6. 轉(zhuǎn)錄組差異分析

TRIzol法提取尾部增生皮膚（實驗組）及尾部正常皮膚（空白對照組）樣本RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性及是否有DNA污染、Nanodrop進(jìn)行RNA濃度和純度檢測。送到北京諾禾致源科技股份有限公司測序平臺進(jìn)行RNA測序。通過文庫構(gòu)建并測序獲得原始測序序列后進(jìn)行信息分析流程，主要由兩個階段：a）評估測序數(shù)據(jù)質(zhì)量；b）信息挖掘及分析。將實驗組與對照組RNA-seq序列進(jìn)行對比，鑒定分析差異基因表達(dá)和聚類分析（包括差異基因數(shù)目統(tǒng)計、GO富集分析、KEGG通路富集分析），采用edgeR軟件進(jìn)行表達(dá)差異顯著性分析。

MmuPV1感染小鼠模型的評價方法包括皮膚觀察、病理檢測、RNAscope原位雜交、PCR方法等；采用的儀器設(shè)備定期檢驗，條件穩(wěn)定，滿足模型評價的要求。