在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，小腸組織是自我更新速度最快的組織之一。整個(gè)小腸黏膜大概每3~5d更新一次，主要依賴于小腸干細(xì)胞的增殖與分化。研究證實(shí)Ascl2、Olfm4、Bmi-1、Hopx等為小腸干細(xì)胞的標(biāo)志基因。在這些標(biāo)記基因中，Lgr5被認(rèn)為是最重要的。從功能上分析，Lgr5編碼G蛋白偶聯(lián)受體，在Wnt信號(hào)通路中起著重要的作用。從數(shù)量上看，Lgr5+干細(xì)胞增殖活躍，具有自我更新的潛能，在所有隱窩的底部均大量存在，以維持小腸上皮的穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞因子- stat5信號(hào)通路調(diào)控可以調(diào)控腸上皮的穩(wěn)態(tài)和損傷反應(yīng)。我們通過特異性敲除腸道上皮細(xì)胞中的STAT5轉(zhuǎn)錄因子將STAT5信號(hào)通路與IESC的增殖分化聯(lián)系起來。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Stat5 flox小鼠，Villin-CreERT2小鼠

試劑：tamoxifen(50mg/kg)，4%PFA

儀器：冰凍切片機(jī)，leica DMI8活細(xì)胞工作站

實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程：將Stat5 flox小鼠與Villin-CreERT2小鼠雜交，在小鼠4周齡時(shí)，提取雜交小鼠鼠尾DNA，通過凝膠電泳檢測(cè)小鼠基因型。STAT5基因PCR引物序列如下1. GAA AGC ATG AAA GGG TTG GAG 2.AGC AGC AAC CAG AGG ACT AC  3.AAG TTA TCT CGA GTT AGT CAG G ,Villin-CreERT2基因PCR引物序列如下:1 GTG TGG GAC AGA CAA ACC  2.ACA TCT TCA GGT TCT GCG GG。選取雙陽(yáng)性小鼠，6~8周齡，體重20~22g。按每只小鼠連續(xù)5天按50mg/ kg腹腔注射他莫西芬。誘導(dǎo)后CO2麻醉處死小鼠，取腸道組織，用冷PBS沖洗腸道組織，置于4%多聚甲醛中固定過夜，1×PBS溶液里浸泡5min。制作冰凍切片及石蠟切片，免疫組化及免疫熒光染色觀察腸道干細(xì)胞的變化。

通過FACS分析敲除STAT5基因后干細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞增殖減少，模型建立成功。