斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio) AB。

1. HCV 亞復(fù)制子基因載體

HCV 亞復(fù)制子基因載體由兩部分組成：mini-HCV genome 和 HCV-RNA 多聚酶 (NS5B)表達(dá)載體。具體構(gòu)建：克隆小鼠肝臟特異的肝核因子 4a(mHNF4a)序列，并將此序列替換我們前期的 HCV 構(gòu)件的 CMV 啟動(dòng)子，獲得含有 GFP 報(bào)告基因的肝臟特異的 mini-HCV genome?？寺“唏R魚的肝型脂肪酸結(jié)合蛋白基因的增強(qiáng)子(L-fabpe) 和人肝脂酶啟動(dòng)子序列(hLP)，并與 NS5B 編碼序列和報(bào)告基因 RFP 序列重組到真核細(xì)胞表達(dá)載體上，獲得肝臟特異的 NS5B 表達(dá)載體。這兩個(gè)基因構(gòu)件結(jié)構(gòu)圖見圖 1A。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型斑馬魚 AB 品系。

3. 造模

取野生型斑馬魚受精卵（1-4 cell 期），通過顯微注射將 HCV 亞復(fù)制子的兩個(gè)基因構(gòu)件混合物(1–5 ng/ml)共注射到受精卵內(nèi)。正常飼養(yǎng)。待胚胎發(fā)育至 4 dpf 幼體，進(jìn)行后續(xù)檢測。

4. 模型分析指標(biāo)

（1） 癥狀觀察

以 WT 斑馬魚為對(duì)照，觀察斑馬魚幼體表型和生長的變化。

（2） 病毒檢測

初篩：熒光顯微鏡下觀察、拍攝幼體內(nèi)報(bào)告基因的表達(dá)分布：在肝臟有綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白共表達(dá)的幼體，即為 HCV 亞復(fù)制子模型個(gè)體。確證：采用斑馬魚整體原位雜交實(shí)驗(yàn)、RT-PCR 和 Western blot 檢測 HCV 亞復(fù)制子的復(fù)制和 HCV 特異的復(fù)制酶 NS5B 的表達(dá)及其肝定位。

（3） 病理診斷

HCV 基因可導(dǎo)致宿主體內(nèi)病理變化，首先反映在相關(guān)基因表達(dá)的變化。我們采用 RT-PCR 和 Western blot 方法檢測了 HCV 的效應(yīng)基因如：Solute carrier family 2 (ScarF2)、Leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5 (Leugpcr)、Ras-related GTP binding D (Rasgbd)和 Argininosuccinate synthetase 1 (Argsyn)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 應(yīng)激和 UPR 相關(guān)基因如：chop、atf4、atf6 和 bip 基因。