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LUMA整體甲基化檢測

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發(fā)布時間：2024-05-21 08:15:32 更新時間：2025-02-18 14:34:20

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DNA甲基化是脊椎動物基因調(diào)控的重要表觀遺傳標(biāo)記，異常甲基化通常與人類疾病如癌癥有關(guān)。在哺乳動物中，甲基化主要發(fā)生在 CpG二核苷酸背景下的胞嘧啶堿基上。 CpG 島是具有高 CpG 含量的基因組區(qū)域，并且通常位于基因啟動子附近，在那里它們調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始。

基因特異性和全基因組 DNA 甲基化可以用多種方法進行分析。LUMA是一種分析全基因組甲基化的快速有效的方法，已經(jīng)在很多文獻中詳細描述。LUMA利用某些限制性內(nèi)切酶的特殊性質(zhì)，這些內(nèi)切酶識別相同的靶序列，但是對甲基化敏感或不敏感。其中HpaII 和 MspI 通常用于 DNA 甲基化分析。這些酶識別 ccgg 序列，但只有 MspI 能夠切斷內(nèi)部胞嘧啶C甲基化的基因序列。在 LUMA 的第一步，感興趣的基因組在兩個不同的反應(yīng)中被消化，要么與 HpaII 和 EcoRI，要么與 MspI 和EcoRI。EcoRI作為一個內(nèi)參酶，評估每個反應(yīng)的裂解效率。在限制性消化后，使用焦磷酸測序通過單核苷酸延伸以定量方式填充所得的5’-cg ( HpaII 和 MspI)和5’-aatt (EcoRI)粘末端

　LUMA優(yōu)點是：無需亞硫酸鹽修飾，無需引物，無需PCR過程，測序反應(yīng)無需磁珠等試劑，十分鐘左右即可完成測序反應(yīng)，方便快捷。而且，該實驗只需要200-500 ng的基因組DNA，并包含一個內(nèi)控以消除起始DNA數(shù)量不同的問題。整個實驗過程能夠在6個小時內(nèi)完成。

5'			C ↓	C	G	G		3‘
3‘			G	G	C ↑	C		5'

HpaII 限制性內(nèi)切酶可識別 C^CGG 位點，對 dam 甲基化不敏感、對 dcm 甲基化不敏感、對 CpG 甲基化敏感。

MspI 限制性內(nèi)切酶可識別 C^CGG 位點，對 dam 甲基化不敏感、對 dcm 甲基化不敏感、對 CpG 甲基化不敏感。

5'			G ↓	A	A	T	T	C		3‘
3‘			C	T	T	A	A ↑	G		5'

EcoRI 是一種DNA 的 G^AATTC限制性內(nèi)切酶，對 dam 甲基化不敏感、對 dcm 甲基化不敏感、對 CpG 甲基化敏感。

材料與方法

應(yīng)用全基因組 DNA/RNA mini 試劑盒提取待檢測樣本基因組 DNA。用Nanodrop 2000測定 DNA 濃度。如上所述(1)進行 Luma，但進行了小的修改。在37 °C 的熱塊中用PCR儀快速限制性消化20分鐘。

對于每個 DNA 樣品，設(shè)置兩個不同的反應(yīng): 混合 A(HpaII 和 EcoRI)和混合 B (MspI 和EcoRI)。Pyromark q48 autoprep 的反應(yīng)體積為6.5 μl，由0.25 μl EcoRI，0.25 μl hpaii 或 mspi，0.5 μl 反應(yīng)緩沖液和5.5 μl dna/水組成。

焦磷酸測序時，將6.5 μl 的酶解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到 Q48圓盤的每個孔中，并通過儀器自動添加6.5 μl 的Pyromark退火緩沖液。將核苷酸依次加入到加樣倉中: 50μl dATP 和50μl 水至“ A”，50μl dTTP 和50μl 水至“ T”，50μl dCTP 和50μl dGTP 至“ C”，100μl 水至“ G”。焦磷酸測序分配序列按照 ACTCGA 核苷酸分配順序進行。由此產(chǎn)生的熱圖包含前三個分配的三個主要峰。峰1和3(a 和 t)對應(yīng)于由 EcoRI 產(chǎn)生的粘末端的填充，并且應(yīng)該具有相似的高度，并且峰2(c + g)由 HpaII 和 MspI 粘末端的填充產(chǎn)生。運行后，高峰高度從Pyromark軟件輸出，并用以下公式計算甲基化水平:

% Methylation = 100 x [1 – (mix A peak 2 / mix A peak 1) / (mix B peak 2 / mix B peak 1)]